革蘭氏陽(yáng)性菌注射劑產(chǎn)品只依賴(lài)內(nèi)毒素檢測(cè)存在安全風(fēng)險(xiǎn)，需結(jié)合熱原檢測(cè)特性制定防控方案。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，而革蘭氏陽(yáng)性菌可產(chǎn)生非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EPs），如脂磷壁酸，這類(lèi)物質(zhì)同樣能引發(fā)人體發(fā)熱反應(yīng)，若只檢測(cè)內(nèi)毒素，可能遺漏 NEPs 污染，導(dǎo)致臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需重點(diǎn)關(guān)注三點(diǎn)：一是建議開(kāi)展家兔法與內(nèi)毒素檢測(cè)的一致性實(shí)驗(yàn)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，排查是否存在內(nèi)毒素未檢出但家兔法陽(yáng)性的情況；二是采用 MAT 法熱原檢測(cè)，其通過(guò)單核細(xì)胞活化機(jī)制，可同時(shí)識(shí)別內(nèi)毒素與 NEPs，若 MAT 法檢測(cè)陽(yáng)性，需進(jìn)一步追溯 NEPs 來(lái)源；三是若無(wú)法排除 NEPs 風(fēng)險(xiǎn)，必須按藥典要求補(bǔ)充熱原檢測(cè)（如 MAT 法或家兔法），而非只依賴(lài)內(nèi)毒素檢測(cè)。尤其對(duì)于新藥或工藝變更后的產(chǎn)品，需通過(guò)多方法驗(yàn)證，確保熱原檢測(cè)覆蓋所有潛在致熱物質(zhì)，保障臨床用藥安全。

湖州申科生物MAT試劑盒配套的即用型細(xì)胞，需嚴(yán)格遵循解凍與使用規(guī)范，避免細(xì)胞活性下降影響熱原檢測(cè)結(jié)果。首先，解凍操作需快速：從液氮罐或 - 80℃冰箱取出細(xì)胞后，立即放入 37℃水浴鍋快速解凍（約 1-2 分鐘），避免緩慢解凍導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，損傷細(xì)胞膜；解凍后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，細(xì)胞解凍后需一次性使用完畢，不建議按量添加培養(yǎng)基或添加劑后分次使用—即用型細(xì)胞經(jīng)工藝優(yōu)化，活性與濃度已預(yù)調(diào)，分次使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不均（如部分細(xì)胞活化、部分休眠），影響熱原反應(yīng)性。使用時(shí)需嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作：將解凍后的細(xì)胞直接加入含樣品的微孔板中，無(wú)需額外洗滌或稀釋?zhuān)魳悠窞楦邼舛然|(zhì)，可提前用無(wú)熱原培養(yǎng)基稀釋樣品（不超 MVD），但細(xì)胞不可稀釋。此外，解凍后的細(xì)胞需在 30 分鐘內(nèi)完成加樣，避免室溫放置過(guò)久導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，若無(wú)法及時(shí)加樣，需置于 37℃培養(yǎng)箱暫存，但不超過(guò) 1 小時(shí)，確保細(xì)胞用于熱原檢測(cè)時(shí)處于較好的活性狀態(tài)。

PyroSHENTEK^®熱原檢測(cè)試劑盒（貨號(hào) 1502100，規(guī)格 96 測(cè)試 / 盒）優(yōu)勢(shì)在于搭載 MAT 特定單核細(xì)胞系，細(xì)胞表面表達(dá)多種 Toll 樣受體（TLR），可響應(yīng)不同類(lèi)型熱原。該細(xì)胞系來(lái)源清晰、可溯源，均一性強(qiáng)且無(wú)供體依賴(lài)，有效規(guī)避了傳統(tǒng) PBMC 因供體差異導(dǎo)致的結(jié)果波動(dòng)，同時(shí)安全風(fēng)險(xiǎn)低，無(wú)需擔(dān)憂(yōu)外源因子污染。試劑盒采用 “標(biāo)準(zhǔn)化單核細(xì)胞 + ELISA 檢測(cè)” 一體化體系，通過(guò)嚴(yán)格的細(xì)胞質(zhì)量控制（如凍存復(fù)融后活率達(dá)標(biāo)），確保每次檢測(cè)的細(xì)胞狀態(tài)一致；搭配預(yù)包被 IL-6 抗體的酶標(biāo)板與配套試劑，進(jìn)一步減少體系誤差。從標(biāo)曲數(shù)據(jù)來(lái)看，其擬合采用 4-Parameter Logistic 模型，R2 達(dá) 1.000，EC50 為 0.119EU/mL，參數(shù)置信區(qū)間穩(wěn)定，復(fù)孔結(jié)果重復(fù)性?xún)?yōu)異，能為熱原定量提供準(zhǔn)確如一的數(shù)據(jù)支撐，避免因體系不穩(wěn)定導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。

MAT法熱原檢測(cè)出現(xiàn) “無(wú)信號(hào)”，需從試劑、實(shí)驗(yàn)操作、儀器三方面定位原因并解決。試劑層面，抗體不足或失活會(huì)導(dǎo)致無(wú)法捕獲 IL-6，需核對(duì)抗體稀釋比例，檢查保存條件（如 2-8℃）與有效期，必要時(shí)更換試劑；底物失效（如變色、沉淀）會(huì)無(wú)法顯色，需觀察底物外觀，失效則更換；混合不同試劑盒試劑會(huì)因成分不匹配導(dǎo)致反應(yīng)失敗，需使用同試劑盒試劑；ELISA 試劑盒保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融）會(huì)破壞試劑活性，需按說(shuō)明書(shū)分條件保存（如抗體 2-8℃、底物避光）。實(shí)驗(yàn)操作中，孵育溫度過(guò)低（<37℃）會(huì)抑制酶促反應(yīng)，需提前將試劑與孔板平衡至室溫，確保孵育溫度達(dá)標(biāo)；洗板機(jī)壓力過(guò)高或手動(dòng)洗滌過(guò)猛，會(huì)洗去結(jié)合的抗體與酶，需調(diào)整洗板機(jī)壓力或輕柔手動(dòng)洗滌；孵育時(shí)孔板未密封導(dǎo)致孔變干，會(huì)使反應(yīng)體系破壞，需用封口膜密封孔板。儀器方面，洗板機(jī)噴頭堵塞會(huì)導(dǎo)致洗滌不均或未洗，需清理噴頭；酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤（未選 450nm）會(huì)無(wú)法檢測(cè)信號(hào)，需確認(rèn)波長(zhǎng)設(shè)置正確。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)家兔體溫應(yīng)答篩查所有類(lèi)型熱原，尤其適用于無(wú)法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無(wú)法滿(mǎn)足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。