陜西熱原檢測(cè)家兔法替代方案

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2025-10-07

PyroSHENTEK^®熱原檢測(cè)試劑盒以 “簡(jiǎn)化流程、提升效率” 為設(shè)計(jì)理念，采用即用型細(xì)胞，凍存細(xì)胞無(wú)需離心復(fù)蘇培養(yǎng)，復(fù)融后可直接與供試品混合共孵育，大幅節(jié)省傳統(tǒng)細(xì)胞預(yù)處理（如調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)、鋪板培養(yǎng)）的時(shí)間成本。實(shí)驗(yàn)流程清晰可控：只需按要求制備待測(cè)供試品與內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，各取對(duì)應(yīng)體積加入細(xì)胞懸液（每孔加樣量明確），經(jīng) 37℃、5% CO?孵育 24 小時(shí)后，離心收集上清并通過(guò) ELISA 法檢測(cè) IL-6 含量，全程可在 24 小時(shí)內(nèi)獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。這種便捷性尤其適配實(shí)驗(yàn)室高通量檢測(cè)需求，減少人員操作步驟的同時(shí)，降低了因復(fù)雜操作引入的誤差風(fēng)險(xiǎn)，兼顧效率與準(zhǔn)確性。

一旦熱原涌入人體循環(huán)系統(tǒng)，致熱因子直抵下丘腦體溫中樞，導(dǎo)致調(diào)定點(diǎn)上移、產(chǎn)熱升散熱降，體溫隨之飆升。陜西熱原檢測(cè)家兔法替代方案

MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定）熱原檢測(cè)基于人體免疫反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來(lái)源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽(yáng)性菌、霉菌、病毒等來(lái)源）進(jìn)入人體后，會(huì)活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測(cè)時(shí)將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過(guò) ELISA 定量檢測(cè)釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測(cè)。

四川化學(xué)制藥熱原檢測(cè)當(dāng)熱原侵入人體循環(huán)系統(tǒng)，單核細(xì)胞表面的TLR即刻化身分子雷達(dá)，準(zhǔn)確捕獲LPS、LTA等外源致熱物。

MAT 法與傳統(tǒng)家兔法在熱原檢測(cè)中，性能差異明顯，MAT 法在準(zhǔn)確性、效率與合規(guī)性上更具優(yōu)勢(shì)。從結(jié)果評(píng)判來(lái)看，MAT 法以 “加標(biāo)回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規(guī)定限值（CLC）” 為合格標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度達(dá) 0.0125EU/mL，可準(zhǔn)確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個(gè)體差異（如免疫狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)）導(dǎo)致假陰性。從檢測(cè)效率來(lái)看，MAT 法樣品與細(xì)胞共培養(yǎng) 24 小時(shí)即可出結(jié)果，且可批量檢測(cè)（96 孔板一次處理多個(gè)樣品）；家兔法需連續(xù)觀察 72 小時(shí)，每次只能檢測(cè)少量樣品，耗時(shí)且人力成本高。從合規(guī)性來(lái)看，MAT 法不使用動(dòng)物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屬性，面臨歐盟等地區(qū)的法規(guī)限制。此外，MAT 法重復(fù)性優(yōu)（復(fù)孔 CV 可控制在 30% 以內(nèi)），家兔法因個(gè)體差異 CV 常超 50%，進(jìn)一步凸顯 MAT 法在現(xiàn)代熱原檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。

湖州申科生物MAT試劑盒配套的即用型細(xì)胞，需嚴(yán)格遵循解凍與使用規(guī)范，避免細(xì)胞活性下降影響熱原檢測(cè)結(jié)果。首先，解凍操作需快速：從液氮罐或 - 80℃冰箱取出細(xì)胞后，立即放入 37℃水浴鍋快速解凍（約 1-2 分鐘），避免緩慢解凍導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，損傷細(xì)胞膜；解凍后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，細(xì)胞解凍后需一次性使用完畢，不建議按量添加培養(yǎng)基或添加劑后分次使用—即用型細(xì)胞經(jīng)工藝優(yōu)化，活性與濃度已預(yù)調(diào)，分次使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不均（如部分細(xì)胞活化、部分休眠），影響熱原反應(yīng)性。使用時(shí)需嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作：將解凍后的細(xì)胞直接加入含樣品的微孔板中，無(wú)需額外洗滌或稀釋，若樣品為高濃度基質(zhì)，可提前用無(wú)熱原培養(yǎng)基稀釋樣品（不超 MVD），但細(xì)胞不可稀釋。此外，解凍后的細(xì)胞需在 30 分鐘內(nèi)完成加樣，避免室溫放置過(guò)久導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，若無(wú)法及時(shí)加樣，需置于 37℃培養(yǎng)箱暫存，但不超過(guò) 1 小時(shí)，確保細(xì)胞用于熱原檢測(cè)時(shí)處于較好的活性狀態(tài)。

MAT 熱原檢測(cè)能幫助分析和解決生物制品生產(chǎn)中出現(xiàn)的低內(nèi)毒素回收（LER）現(xiàn)象。

MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵機(jī)制是 “熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，觸發(fā)炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測(cè)無(wú)遺漏的關(guān)鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見(jiàn)的內(nèi)毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缰妆谒幔┬杌罨?TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細(xì)胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達(dá)—湖州申科生物通過(guò) Western blot 驗(yàn)證，其 HL-60 細(xì)胞系表達(dá) TLR1-TLR9，可響應(yīng)各類熱原。為進(jìn)一步驗(yàn)證覆蓋能力，申科用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示所有配體均能誘導(dǎo) IL-6 分泌，且呈良好量效關(guān)系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細(xì)胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無(wú)法檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩瑢?dǎo)致漏檢風(fēng)險(xiǎn)，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一。

細(xì)胞因子IL-6因穩(wěn)定性高、半衰期長(zhǎng)，被選為熱原檢測(cè)MAT法關(guān)鍵定量指標(biāo)，優(yōu)于TNF-α與IL-1β。疫苗熱原檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

湖州申科熱原檢測(cè)試劑盒聯(lián)合了國(guó)內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)室間驗(yàn)證，與傳統(tǒng)RPT法結(jié)果高度一致，符合法規(guī)要求。陜西熱原檢測(cè)家兔法替代方案

MAT法熱原檢測(cè)出現(xiàn) “無(wú)信號(hào)”，需從試劑、實(shí)驗(yàn)操作、儀器三方面定位原因并解決。試劑層面，抗體不足或失活會(huì)導(dǎo)致無(wú)法捕獲 IL-6，需核對(duì)抗體稀釋比例，檢查保存條件（如 2-8℃）與有效期，必要時(shí)更換試劑；底物失效（如變色、沉淀）會(huì)無(wú)法顯色，需觀察底物外觀，失效則更換；混合不同試劑盒試劑會(huì)因成分不匹配導(dǎo)致反應(yīng)失敗，需使用同試劑盒試劑；ELISA 試劑盒保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融）會(huì)破壞試劑活性，需按說(shuō)明書(shū)分條件保存（如抗體 2-8℃、底物避光）。實(shí)驗(yàn)操作中，孵育溫度過(guò)低（<37℃）會(huì)抑制酶促反應(yīng)，需提前將試劑與孔板平衡至室溫，確保孵育溫度達(dá)標(biāo)；洗板機(jī)壓力過(guò)高或手動(dòng)洗滌過(guò)猛，會(huì)洗去結(jié)合的抗體與酶，需調(diào)整洗板機(jī)壓力或輕柔手動(dòng)洗滌；孵育時(shí)孔板未密封導(dǎo)致孔變干，會(huì)使反應(yīng)體系破壞，需用封口膜密封孔板。儀器方面，洗板機(jī)噴頭堵塞會(huì)導(dǎo)致洗滌不均或未洗，需清理噴頭；酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤（未選 450nm）會(huì)無(wú)法檢測(cè)信號(hào)，需確認(rèn)波長(zhǎng)設(shè)置正確。

陜西熱原檢測(cè)家兔法替代方案

標(biāo)簽：宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè) 內(nèi)毒素檢測(cè) 宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè) 熱原檢測(cè)

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