熱原檢測結果判定

來源：發布時間：2025-09-29

MAT 法熱原檢測的穩定性需從細胞、試劑、操作、樣品四維度嚴格把控。細胞層面，細胞活性與純度直接決定熱原響應能力，活性不足會減少炎癥因子分泌，純度低則引入雜細胞干擾；細胞批次間一致性也關鍵，TLR 受體表達、倍增時間差異會導致結果波動。試劑與耗材方面，標準品效價需溯源國際標準，避免降解影響標曲；試劑盒中細胞因子需質控，防止外源熱原污染；培養液、緩沖液及無熱原耗材（吸頭、西林瓶）若熱原控制不當，易引發假陽性。操作上，加樣手法要統一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO?穩定環境，試劑配制濃度準確，設備（酶標儀、洗板機）定期校準，操作偏差會直接導致異常。樣品層面，自身干擾物質（消除炎癥成分、高鹽）、pH 偏離 6-8 或微生物污染，會抑制細胞活化或引入外源熱原，需針對性預處理。

中國藥典9301已將MAT列為熱原檢測的補充方法，美國藥典鼓勵企業采用經過驗證的MAT替代家兔法。熱原檢測結果判定

在 MAT 熱原檢測中，單核細胞系與 PBMC（外周血單個核細胞）的檢測結果穩定性差異明顯。實驗結果數據顯示，單核細胞系的標曲 R2 達 1.000，各濃度點 CV 值極低（如 ST1 為 0.92%、ST2 為 1.5%），相對偏差均在 5% 以內；而 PBMC 的標曲 R2 為 0.997，部分濃度點 CV 值超 20%（如 ST2 為 39.6%、ST6 為 45.5%），相對偏差高達 171.43%。這種差異源于兩者對熱原反應的一致性—單核細胞系能穩定釋放 IL-6，PBMC 則因供體差異導致 IL-6 釋放水平波動，直接影響熱原檢測結果的重復性，單核細胞系更適配準確的熱原定量需求。

浙江熱原檢測合規申報MAT 熱原檢測能幫助分析和解決生物制品生產中出現的低內毒素回收（LER）現象。

單核細胞活化反應測定（MAT）是近年來熱原檢測領域的突破性技術，其原理基于人體免疫系統對熱原的天然應答機制：人源單核細胞（如 THP-1 細胞系或新鮮人全血單核細胞）在熱原刺激下，會活化胞內炎癥信號通路，釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細胞因子，通過 ELISA 檢測細胞因子的濃度，即可間接反映樣品中熱原的總量與活性。與傳統檢測方法相比，MAT 法具備三大不可替代的優勢：一是廣譜性，可同時檢測細菌內毒素、病毒、真菌毒素、支原體等所有類型熱原，填補了鱟試驗法只能檢測內毒素的 “非內毒素熱原盲區”，尤其適用于疫苗、基因治療產品等易受多種熱原污染的高風險產品；二是人源相關性，采用與人體同源的細胞模型，檢測結果更貼近臨床實際熱原反應，避免家兔試驗中動物種屬差異導致的誤判；三是高靈敏度，對細菌內毒素的檢測限可達 0.0125EU/mL，對非內毒素熱原（如酵母多糖、腺病毒）的檢測限低至 ng/pg 級，滿足低限值產品的質控需求。

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒依據 ICH Q2 (R2)、《中國藥典》（如通則 9301）及歐洲藥典（EP 2.6.30）要求，完成了線性、范圍、定量限、準確度、精密度、耐用性等全維度性能驗證。線性方面，0.0125-1.0EU/mL范圍內擬合良好，R2≥0.98；準確度通過加標回收實驗驗證，不同樣品基質（如生物制品、化學制藥原料）的回收率均落在 50%-200% 區間；精密度表現優異，批內與批間 CV 均≤15%，且無論是 3 復孔還是 4 復孔檢測均能達標。此外，試劑盒使用中國藥典推薦的 MAT 特定標準品，可直接用于國內外申報，契合全球 “3R 原則” 監管導向—尤其適配《歐洲藥典》刪除家兔法、《美國藥典》鼓勵 MAT 替代等新法規趨勢，為企業應對不同地區的熱原檢測合規要求提供有力支持。

MAT 法檢測革蘭氏陽性菌注射劑，需排查非內毒素熱原（如 LTA），避免只測內毒素漏檢。

MAT 法熱原檢測標曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優勢在于提升標曲準確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關鍵濃度區間：熱原檢測的重點關注區為低濃度拐點（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺區（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區間設置更多濃度點（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點少，易導致低濃度熱原定量不準。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會累積，導致低濃度點實際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過單獨配制每個濃度點（如直接用標準品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據樣品預期濃度調整標曲范圍，如樣品預期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點，確保樣品濃度落在標曲線性區，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優勢使非倍比稀釋成為 MAT 法標曲配制的優先選擇方式。

熱原檢測歷經動物整體試驗、體外生化反應到細胞免疫應答的三階段演進，靈敏度與效率不斷提升。上海非動物源熱原檢測風險評估

熱原檢測采用人外周血單核細胞（PBMC），優勢是天然受體譜系完整，但供體差異導致變異系數（CV）高達25%。熱原檢測結果判定

MAT法熱原檢測中，樣品與細胞共培養時長需嚴格控制，以保障炎癥因子分泌量穩定。說明書要求共培養 24 小時，雖未明確允差，但實驗驗證顯示，±30 分鐘的允差對結果無明顯影響 —— 細胞因子（如 IL-6）分泌具有時間依賴性，24 小時左右達到分泌平臺期，半小時差異不會導致分泌量大幅波動。若實驗室對結果穩定性要求極高（如 QC 放行檢測），建議嚴格按 24 小時操作，避免因時長差異引入誤差；若為預實驗（如樣品稀釋倍數摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實際培養時長。需注意的是，共培養時長不可超過 26 小時或短于 22 小時：過長會導致細胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過短則未達分泌平臺期（檢測信號偏低），均可能導致熱原濃度低估。此外，培養環境需保持穩定（37℃、5% CO?），溫度波動會影響細胞代謝，間接導致共培養時長的實際效果偏離，因此需定期校準培養箱溫度，確保環境條件一致。

熱原檢測結果判定

標簽：宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測熱原檢測內毒素檢測宿主細胞殘留DNA檢測

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