上海化學制藥熱原檢測規范

來源：發布時間：2025-10-03

隨著發熱反應分子機制研究的不斷深化，單核細胞活化試驗（MAT）作為一種體外熱原檢測技術，愈發受到醫藥與醫療器械行業的關注并逐步推廣應用。該方法的原理是：讓人體全血與待檢樣品中的熱原充分接觸后，通過檢測體系中產生的 IL-1β、IL-6（因穩定性強、重復性優，常作為關鍵檢測指標）、TNF 等促炎細胞因子含量，實現對熱原污染程度的評估，整個過程能高度模擬人體先天免疫系統對熱原的應答反應。相較于傳統熱原檢測手段，MAT 的優勢更為突出：不僅可檢出各類熱原污染物，包括尚未明確性質的未知熱原，以及革蘭氏陽性菌（脂磷壁酸）、真菌、病毒等產生的非內毒素熱原，填補了傳統內毒素檢測（如鱟試劑法）的覆蓋空白。此外，MAT 無需使用實驗動物，契合全球 “替代、減少、優化”（3R 原則）的監管導向，目前已被《歐洲藥典》等法規列為家兔熱原試驗的替代方法，進一步提升了其在合規檢測中的適用性。

單核細胞系傳代可控，20代以內TLR表達與炎癥因子分泌保持穩定，確保熱原響應一致性。上海化學制藥熱原檢測規范

湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT 法，貨號 1502100）包含完整的檢測體系，組分按功能可分為細胞培養類、ELISA 檢測類與輔助類，且儲存條件明確。細胞培養類組分包括：2-8℃儲存的培養液（25mL×2 瓶）、96 孔細胞孵育板，-18℃儲存的培養液添加劑（1.5mL×1 管）、細菌內毒素工作標準品，以及需液氮保存的 MAT 細胞（2 支），確保細胞活性與穩定性。ELISA 檢測類組分涵蓋：2-8℃儲存的生物素偶聯抗 IL-6 抗體（200×，60μL）、鏈霉親和素 HRP 復合物（100×，140μL）、TMB 顯色液（12mL）、終止液（6mL），以及抗 IL-6 預包被酶標板（8 孔 ×12 條），無需額外制備抗體，即開即用。輔助類組分包括細菌內毒素檢查用水（8mL×1 管）、稀釋液（25mL）、濃縮緩沖液（10×，25mL×2 瓶）與封板膜，滿足從樣品稀釋到檢測終止的全流程需求。各組分儲存條件嚴格區分，避免因儲存不當導致性能下降，保障檢測結果可靠。

化學制藥熱原檢測MAT試劑盒保持細胞活性穩定，是實現準確熱原檢測的基礎條件。

相較于傳統家兔法，熱原檢測MAT法在動物福利、檢測性能、適用范圍等方面具有明顯優勢。從動物福利看，MAT法使用分離培養的單核細胞系（如湖州申科 HL-60 細胞系），無需動物，完全符合 “減少、替代、優化” 的 3R 原則，規避家兔法的倫理爭議與飼養成本。檢測性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），結果受動物個體差異、環境溫度影響大；MAT 法可定量檢測，標曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測限（LOD）達 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復性更優。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質藥物、基因療法制劑等可能影響動物體溫的產品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測，單塊 96 孔板可同時分析多個樣品，檢測時間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

MAT法（單核細胞活化反應測定）熱原檢測基于人體免疫反應機制設計，原理是：內毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內毒素熱原（革蘭氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進入人體后，會活化單核細胞或單核細胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子。檢測時將供試品與單核細胞 / 單核細胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測釋放的 IL-6 含量，結合內毒素標準品繪制的標曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規定，實現內毒素與非內毒素熱原的全覆蓋檢測。

選擇熱原檢測單核細胞活化反應測定法，即是選擇更準確、更安全、更可持續的檢測方案。

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒依據 ICH Q2 (R2)、《中國藥典》（如通則 9301）及歐洲藥典（EP 2.6.30）要求，完成了線性、范圍、定量限、準確度、精密度、耐用性等全維度性能驗證。線性方面，0.0125-1.0EU/mL范圍內擬合良好，R2≥0.98；準確度通過加標回收實驗驗證，不同樣品基質（如生物制品、化學制藥原料）的回收率均落在 50%-200% 區間；精密度表現優異，批內與批間 CV 均≤15%，且無論是 3 復孔還是 4 復孔檢測均能達標。此外，試劑盒使用中國藥典推薦的 MAT 特定標準品，可直接用于國內外申報，契合全球 “3R 原則” 監管導向—尤其適配《歐洲藥典》刪除家兔法、《美國藥典》鼓勵 MAT 替代等新法規趨勢，為企業應對不同地區的熱原檢測合規要求提供有力支持。

熱原檢測歷經動物整體試驗、體外生化反應到細胞免疫應答的三階段演進，靈敏度與效率不斷提升。上海血液制品熱原檢測MAT法

與傳統方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產品安全性。上海化學制藥熱原檢測規范

MAT法熱原檢測中，獲得標準 S 型標曲需通過顯色時機控制與圖形調整實現，確保標曲擬合準確。在顯色時機控制上，加入 TMB 底物后，孔內顏色會逐漸變藍，且隨反應時間加深，當標準品濃度梯度呈現明顯藍色差異（如高濃度孔深藍色、低濃度孔淺藍色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標準品的 OD600nm 值，當達到 1.0 左右時終止，此時顯色反應處于線性期，終止后顏色由藍變黃，信號強度約增強 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調整上，若標曲擬合后未呈現明顯 S 型，可通過調整坐標軸范圍優化—如將縱軸（OD 值）范圍設為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設為對數坐標，突出低濃度區的拐點與高濃度區的平臺區，使曲線更接近 S 型。此外，標曲配制需確保濃度點單獨配制（非連續稀釋），避免高濃度標準品污染低濃度點，導致低濃度區信號異常升高，破壞 S 型曲線形態。通過以上方法，可有效提升 S 型標曲的成功率，保障熱原定量的準確性。

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標簽：內毒素檢測宿主細胞殘留DNA檢測熱原檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測

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