熱原檢測單核細胞活化反應測定法

來源：發布時間：2025-10-01

單核細胞系培養的高度可控性，為熱原檢測結果的可靠性提供關鍵保障。其培養基配方（如營養成分、血清濃度）可定制，確保細胞獲取充足營養；培養環境（37℃、5% CO?、濕度≥90%）可恒定控制，維持細胞好的活性與 TLR 受體表達水平，避免因環境波動導致細胞功能異常。這種可控性還能防止細胞遺傳突變與外源污染（如支原體、病毒），確保不同批次單核細胞系的熱原響應一致性，讓熱原檢測結果批間差異小，符合 GMP 對檢測方法穩定性的要求。

保持細胞活性穩定，是實現準確熱原檢測的基礎條件。熱原檢測單核細胞活化反應測定法

MAT法（單核細胞活化反應測定）熱原檢測基于人體免疫反應機制設計，原理是：內毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內毒素熱原（革蘭氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進入人體后，會活化單核細胞或單核細胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子。檢測時將供試品與單核細胞 / 單核細胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測釋放的 IL-6 含量，結合內毒素標準品繪制的標曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規定，實現內毒素與非內毒素熱原的全覆蓋檢測。

湖北熱原檢測常見問題分析熱原檢測歷經動物整體試驗、體外生化反應到細胞免疫應答的三階段演進，靈敏度與效率不斷提升。

MAT法熱原檢測中，標曲信號值偏低或線性不佳是常見問題，需按細胞、標準品、ELISA 檢測三環節排查解決。細胞相關問題中，細胞復蘇后若未充分混勻導致結團，種板后細胞分布不均，會使局部信號弱，需振蕩細胞懸液后再種板；細胞活性差或處理時間超半小時，會降低炎癥因子分泌，需嚴格按說明書操作并縮短處理時間；孵育未達 37℃、5% CO?條件，細胞活化不足，需確保培養箱參數穩定；細胞懸液若接觸外源熱原，會引發非特異性反應，操作時需遠離熱原污染源。標準品問題方面，配制稀釋錯誤會直接導致濃度不準，需核對稀釋步驟；振蕩時間不足（未按說明書要求）會使內毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時內使用；標準品降解會導致效價下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測環節，孵育時間短或振蕩速度慢會影響抗體結合，可適當延長孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會導致信號低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點 OD600 達 1.0 時加終止液。

MAT法熱原檢測出現 “無信號”，需從試劑、實驗操作、儀器三方面定位原因并解決。試劑層面，抗體不足或失活會導致無法捕獲 IL-6，需核對抗體稀釋比例，檢查保存條件（如 2-8℃）與有效期，必要時更換試劑；底物失效（如變色、沉淀）會無法顯色，需觀察底物外觀，失效則更換；混合不同試劑盒試劑會因成分不匹配導致反應失敗，需使用同試劑盒試劑；ELISA 試劑盒保存不當（如反復凍融）會破壞試劑活性，需按說明書分條件保存（如抗體 2-8℃、底物避光）。實驗操作中，孵育溫度過低（<37℃）會抑制酶促反應，需提前將試劑與孔板平衡至室溫，確保孵育溫度達標；洗板機壓力過高或手動洗滌過猛，會洗去結合的抗體與酶，需調整洗板機壓力或輕柔手動洗滌；孵育時孔板未密封導致孔變干，會使反應體系破壞，需用封口膜密封孔板。儀器方面，洗板機噴頭堵塞會導致洗滌不均或未洗，需清理噴頭；酶標儀波長設置錯誤（未選 450nm）會無法檢測信號，需確認波長設置正確。

中國藥典規定 MAT 法標曲需 4 個平行孔、濃度點≥4，推薦四參數擬合，r≥0.90。

MAT法熱原檢測中，ELISA 加終止液后的讀數時間需嚴格控制，以保障 IL-6 檢測信號穩定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內完成讀數，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會終止 TMB 顯色反應，但生成的黃色產物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會下降，導致 IL-6 檢測值偏低。讀數前需進行 30 秒震蕩混勻，確保孔內液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導致復孔 OD 值波動。酶標儀波長需設置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長，可同時檢測 600nm 波長以扣除背景干擾（如細胞碎片導致的光散射），提升檢測準確性。需注意的是，讀數時不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結的水蒸氣滴入孔中，導致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時讀數，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內完成讀數，同時在記錄中注明延遲原因，評估延遲對結果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

湖州申科 MAT法熱原檢測試劑盒細胞復融后可直接使用，無需離心復蘇，24 小時內出檢測結果。山西熱原檢測體系

單核細胞活化試驗MAT通過量化人源單核細胞的免疫應答，實現對LPS、脂磷壁酸、β-葡聚糖的同步檢測。熱原檢測單核細胞活化反應測定法

熱原是能引發恒溫動物體溫異常升高的物質總稱，主要成分為細菌內毒素（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS），同時涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內毒素熱原，其檢測是保障藥品與醫療器械安全性的關鍵環節。當前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補的完整體系：以鱟試驗法（含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑）作為細菌內毒素的特異性檢測手段，憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業常規質控方法，可通過凝膠法實現定性、動態濁度 / 顯色法完成定量；以家兔熱原試驗作為傳統廣譜篩查方法，雖操作繁瑣（需預試篩選基礎體溫穩定家兔，正式試驗觀察 3 小時體溫變化），但仍是放射性質的藥物、血液制品等高風險產品排除非內毒素熱原的補充手段；以單核細胞活化反應測定（MAT）作為新興全熱原檢測技術，利用人源單核細胞（如 THP-1 細胞）釋放 IL-6、TNF-α 等細胞因子的特性，可同時識別內毒素與非內毒素熱原，契合疫苗、基因治療產品等對風險控制的需求。三種方法協同應用，從原料入廠到成品放行構建全流程熱原防控網絡，既保證對內毒素的準確監控，又避免非內毒素熱原的遺漏風險。

熱原檢測單核細胞活化反應測定法

標簽：宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測宿主細胞殘留DNA檢測熱原檢測內毒素檢測

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