TthDNAPolymerase（5U/μL）是一種從嗜熱菌_Thermusthermophilus_HB8中發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶。以下是其主要特點(diǎn)和應(yīng)用：1.**熱穩(wěn)定性**：TthDNAPolymerase在高溫下具有高穩(wěn)定性，其在74°C時(shí)可進(jìn)行DNA復(fù)制，在95°C的半衰期為20分鐘。這種熱穩(wěn)定性使得該酶在高溫下的PCR反應(yīng)中保持活性。2.**催化活性**：該酶在Mg2+存在的條件下具有5′-3′DNA聚合酶活性和5′-3′核酸外切酶活性，無(wú)3′-5′核酸外切酶活性。在Mn2+存在的條件下，該酶在55-70℃條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄活性，可用于一步法RT-PCR反應(yīng)。3.**高純度**：TthDNAPolymerase的蛋白純度（SDS-PAGE）≥95%，無(wú)核酸外切酶、DNase、RNase殘留。4.**PCR應(yīng)用**：適用于常規(guī)PCR和RT-PCR。在PCR擴(kuò)增中，TthDNAPolymerase能夠擴(kuò)增DNA片段，且具有5′→3′外切酶活性。在RT-PCR中，由于其內(nèi)在的Mn依賴性逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）活性，可以有效地將靶標(biāo)RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。5.**靈敏度**：PCR擴(kuò)增檢測(cè)靈敏度可達(dá)100pg。6.**單位定義**：在70°C條件下，30分鐘內(nèi)催化10nmoldNTP摻入到TCA不溶性物質(zhì)所需的酶量為一個(gè)單位。7.**儲(chǔ)存條件**：干冰運(yùn)輸。-20℃以下儲(chǔ)存，有效期2年。高效分離：TBE緩沖液具有較高的離子強(qiáng)度，適合分離小分子量的DNA片段。北京畢赤酵母表達(dá)病毒樣顆粒技術(shù)服務(wù)技術(shù)服務(wù)

StrandcDNASynthesisKit在逆轉(zhuǎn)錄過程中保證cDNA特異性的特點(diǎn)主要包括：1.**高效的逆轉(zhuǎn)錄酶**：該試劑盒通常包含高效且熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶，如HiScriptIIReverseTranscriptase，能夠在高溫條件下打開RNA的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而提高逆轉(zhuǎn)錄效率。2.**寬泛的模板起始量**：試劑盒可以從1pg到5μg的總RNA模板合成cDNA，且能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)15kb以上的片段。3.**高效的cDNA合成**：AnchoredOligo(dT)23VN設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)錨定，特異性高，保證鏈cDNA合成效率和成功率。4.**靈活的引物選擇**：提供不同類型的逆轉(zhuǎn)錄引物，如Oligo(dT)、隨機(jī)六聚體引物或基因特異性引物，以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。5.**去除基因組DNA**：部分試劑盒包含gDNA去除模塊，如gDNAwiperMix，可以去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續(xù)結(jié)果更加可靠。6.**RNase抑制劑**：試劑盒中包含RNase抑制劑，保護(hù)模板RNA在逆轉(zhuǎn)錄過程中不被降解，確保逆轉(zhuǎn)錄效率和特異性。7.**優(yōu)化的反應(yīng)條件**：試劑盒通常提供優(yōu)化的反應(yīng)條件，包括反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶和引物的組合，以確保高效的cDNA合成。浙江畢赤酵母分泌表達(dá)技術(shù)服務(wù)AdvanceFast PCR Master Mix (2×) (With Dye) 采用了優(yōu)化的高保真DNA聚合酶和反應(yīng)體系能夠?qū)崿F(xiàn)超快速的PCR擴(kuò)增。

除了CRISPR-Cas9技術(shù)，還有其他幾種基因編輯技術(shù)可以用于金黃色葡萄球菌的研究：1.單堿基編輯技術(shù)：這是一種新型的基因編輯技術(shù)，可以在不切割DNA雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變。季泉江教授課題組與中國(guó)科學(xué)院北京基因組所韓大力研究員課題組合作，在金黃色葡萄球菌中建立了單堿基編輯技術(shù)，通過融合失活的Cas9蛋白（Cas9D10A）和胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），實(shí)現(xiàn)了高效單堿基編輯，有助于研究耐藥機(jī)制和開發(fā)新型手段。2.同源重組（HR）修復(fù)技術(shù)：在某些細(xì)菌中，可以通過同源重組機(jī)制對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的雙鏈DNA斷裂進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因的精確編輯。例如，在谷氨酸棒桿菌中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合同源重組修復(fù)模板，實(shí)現(xiàn)了高效的基因缺失和點(diǎn)突變。3.非同源末端連接（NHEJ）相關(guān)蛋白共表達(dá)：通過共表達(dá)Cas9蛋白和NHEJ相關(guān)蛋白，如連接酶LigD，可以在鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)有效的基因組編輯，這種方法不依賴于同源重組，可以應(yīng)用于那些同源重組效率較低的細(xì)菌。4.CRISPR干擾技術(shù)（CRISPRi）：利用失活的Cas9蛋白（dCas9）阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制特定基因的表達(dá)。這種技術(shù)可以用于研究基因功能和調(diào)控基因表達(dá)，已經(jīng)在多種細(xì)菌中得到應(yīng)用。

在qRT-PCR反應(yīng)中避免非特異性擴(kuò)增，可以采取以下措施：1.**優(yōu)化引物設(shè)計(jì)**：確保引物與目標(biāo)序列具有高度特異性，避免引物二聚體和非特異性結(jié)合。引物應(yīng)設(shè)計(jì)成長(zhǎng)度在15-30bp，GC含量在40%-60%，并避免引物3端的互補(bǔ)序列。2.**模板RNA的質(zhì)量和純度**：確保RNA樣本無(wú)DNA污染，純度高，完整性好?？梢酝ㄟ^電泳法檢測(cè)RNA的完整性，確保有清晰的28s和18srRNA條帶。3.**使用熱啟動(dòng)酶**：熱啟動(dòng)酶在高溫下才開始活性，可以減少非特異性擴(kuò)增。4.**優(yōu)化Mg2+濃度**：Mg2+濃度對(duì)PCR特異性影響很大，過高的Mg2+濃度可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。5.**控制dNTP濃度**：dNTP濃度應(yīng)為50-200μM，且四種dNTP的濃度要相等，以避免過高dNTP與Mg2+結(jié)合，降低游離的Mg2+濃度。6.**模板稀釋**：如果模板量過高，可以嘗試稀釋模板以降低非特異性擴(kuò)增。7.**使用UNG酶**：在反應(yīng)體系中加入尿嘧啶糖基化酶（UNG）和dUTP，可以消除PCR產(chǎn)物的污染。8.**優(yōu)化反應(yīng)條件**：包括退火溫度和延伸時(shí)間，以確保引物與模板的正確結(jié)合。9.**使用熔解曲線分析**：通過熔解曲線分析可以檢測(cè)是否有非特異性擴(kuò)增，理想的熔解曲線應(yīng)為單峰?；蚓庉嫾夹g(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用還包括生物制藥領(lǐng)域。

人胎盤RNases抑制劑在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有多種應(yīng)用，主要包括：1.**保護(hù)RNA不被降解**：在cDNA合成、體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯以及mRNA-protein復(fù)合物分離純化等過程中，RNaseInhibitor可以保護(hù)RNA不被RNases降解。2.**特定RNase活性的鑒定**：RNaseInhibitor也可用于實(shí)驗(yàn)中鑒定特定的RNase活性。3.**與多種酶的兼容性**：它與多種DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶兼容，如TaqDNA聚合酶、AMV或M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶等，不會(huì)抑制這些聚合酶的活性。4.**pH穩(wěn)定性**：在pH5-8范圍內(nèi)保持RNA酶抑制活性，在pH7-8時(shí)抑制活性高。5.**高親和力結(jié)合**：RNaseInhibitor能夠以1:1的比例與RNase通過非共價(jià)鍵結(jié)合，具有非常高的親和力，其結(jié)合常數(shù)大于10^14^。6.**抗氧化能力**：對(duì)于升級(jí)版的人胎盤RNases抑制劑（RNaseInhibitorPlus,HumanPlacenta），它通過基因工程突變改造獲得，不含對(duì)氧化環(huán)境敏感的半胱氨酸，因此具備更高的抗氧化能力。7.**His-tag純化**：產(chǎn)品N端帶有His-tag，可以通過相應(yīng)的His抗體檢測(cè)或通過磁珠、鎳柱吸附去除，方便實(shí)驗(yàn)中對(duì)RNaseInhibitor的檢測(cè)和去除。這些應(yīng)用使得人胎盤RNases抑制劑成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中保護(hù)RNA和研究RNA酶活性的重要工具。Cre/LoxP系統(tǒng)適用于真核和原核生物，廣泛應(yīng)用于基因敲除、插入、翻轉(zhuǎn)和易位等操作。浙江畢赤酵母分泌表達(dá)技術(shù)服務(wù)

50×TAE是一種高濃度的緩沖液，主要成分包括Tris（三羥甲基氨基甲烷）、醋酸鈉和EDTA（乙二胺四乙酸）。北京畢赤酵母表達(dá)病毒樣顆粒技術(shù)服務(wù)技術(shù)服務(wù)

Thioredoxin-NP-27是一種腸激酶的底物，用于檢測(cè)腸激酶的活性。它是由硫氧還蛋白和NP-27融合而成，中間通過腸激酶的酶切位點(diǎn)（DDDDK）連接。這種底物在經(jīng)過腸激酶酶切后，可以通過SDS-PAGE電泳觀察到分子量分別為18kDa和27kDa的兩條帶。腸激酶是一種高度專一性識(shí)別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋白酶，它在Lys的C端水解多肽。腸激酶可以將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橐让?，也可以將帶有這個(gè)識(shí)別序列的融合蛋白切開。在37℃，16小時(shí)內(nèi)將0.5mg的反應(yīng)底物Thioredoxin-NP-27切割為NP-27達(dá)95%所需的酶量定義為一個(gè)單位。腸激酶的活性單位定義為在37℃，16小時(shí)內(nèi)將0.5毫克的Thioredoxin-NP-2795%降解為NP-27所需要的酶量。這種酶在基因工程產(chǎn)品開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用，特別是作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂。Thioredoxin-NP-27產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)在于它符合GB/T41907-2022標(biāo)準(zhǔn)，適用于腸激酶活性檢測(cè)的底物。產(chǎn)品保存條件為-30~-15℃，運(yùn)輸條件為≤0℃，以確保其穩(wěn)定性和活性。使用時(shí)，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作，并注意安全防護(hù)措施。北京畢赤酵母表達(dá)病毒樣顆粒技術(shù)服務(wù)技術(shù)服務(wù)